În această etapa a proiectului au fost elaborate metode experimentale de evidențiere a sinergismului polifenolilor si polizaharidelor din pomace de fructe de padure si din seminte de chia, in ceea ce priveste activitatea antioxidanta a acestor compusi.

• S-a realizat extractia componentelor din sursele studiate si s-a determinat atat activitatea lor antioxidanta, cat si activitatea antioxidanta a amestecului acestora in diferite rapoarte de combinare. S-a determinat astfel ca cel mai pronuntat efect antioxidant sinergic al celor doua clase de compusi se manifesta atunci cand raportul de combinare este de 5:1 – polifenoli din fructe de padure : polizaharide din seminte de chia.



Fig.1 Efectul antioxidant sinergic al extractelor de polifenoli si polizaharide

• Efectul antioxidant sinergic al acestui raport a fost evidentiat si prin efectul de inhibare a α-amilazei. Rezultatele obtinute au aratat ca amestecul de extract polifenolic din pomace si extract de polizaharide din chia in raport de 5:1 (v:v) (PF-FP : PZ-Ch 5:1) are cea mai mare activitate de inhibare a α-amilazei (59,96%), mai mare decat suma valorilor obtinute pentru cele doua componente ale amestecului, ceea ce demonstreaza ca acest amestec are un efect sinergic si din acest punct de vedere.
• S-a realizat verificarea sinergismului componentelor amestecului (polifenoli si polizaharide) in culturi celulare prin determinarea activitatii antioxidante pe linia celulara Caco-2, dupa simularea in vitro a digestiei amestecului. S-a verificat efectul protector al amestecului împotriva actiunii H2O2 asupra celulelor in cultura. Probele derivate din digestia intestinala simulata au exercitat un efect antioxidant mai pronunțat față de probele provenite din digestia gastrica, ceea ce confirma efectul antioxidant sinergic al polifenolilor si polizaharidelor din sursele studiate. Rezultatele obtinute in urma analizei speciilor reactive de oxigen (ROS) au aratat ca tratamentul celulelor Caco-2 cu probele studiate a prezentat un efect antioxidant puternic, observandu-se o scadere semnificativa a nivelului de ROS pâna la 36,41 %.
• S-a testat un model experimental de amplificare a efectului prebiotic al polizaharidelor de către polifenoli, prin co-cultivarea celulele intestinale Caco-2 cu tulpinile bacteriene probiotice Lactobacillus rhamnosus si Lactobacillus acidophillus, in prezenta probelor de polifenoli si polizaharide. Dupa 24h de incubare, s-a observat o aderenta crescuta a lactobacililor la substratul celular in prezenta probelor testate, comparativ cu martorul reprezentat de celule intestinale incubate doar in prezenta lactobacililor, ceea ce demonstreaza existenta unui efect prebiotic al polizaharidelor extrase de noi si care este potentat de prezenta polifenolilor.
• S-au dezvoltat modele de formulare nanolipidica, obtinand lipozomi prin dispersia a doua tipuri de amestecuri lipidice naturale, lecitina din soia si un amestec purificat de fosfolipide din soia cu un continut de 25% fosfatidilcolina, in mediu apos, in care a fost incorporata compozitia sinergica selectata formata din polifenoli din pomace si polizaharide din chia in raport 5:1 (g/g).



Fig.2 Combinatia de polifenoli si polizaharide cu efect antioxidant sinergic microincapsulata utilizand proteine din zer si inulina ca matrice de incapsulare



Fig.3 Reprezentarea schematica si imaginii de microscopie electronica a formularilor nanolipidice ale amestecului sinergic polifenoli – polizaharide

• S-a realizat un model experimental de formulare a produsului hipocaloric, stabilindu-se reteta si modul de conditionare.

Conform planului de realizare a proiectului, in aceasta etapa s-au obtinut:

• 1 combinație sinergică antioxidantă polifenoli – polizaharide: combinatia in raport de 5:1 polifenoli din fructe de padure : polizaharide din chia, pentru care s-a demonstrat prin mai multe metode (activitate antioxidanta, efect de inhibare a α-amilazei, activitate antioxidanta in culturi celulare) efectul antioxidant sinergic;
• 1 combinație sinergică cu efect prebiotic: s-a demonstrat efectul prebiotic al combinatiei sinergice in raport de 5:1 polifenoli din fructe de padure : polizaharide din chia printr-un experiment de co-cultura intre celule epiteliale intestinale si bacterii probiotice;
• 1 formulare nanolipidică pentru combinațiile selectate: s-au testat mai multe modele experimentale de formulare nanolipidică si s-a selectat o formulare lipozomala a compozitiei sinergice sub forma de pudra (pasta), care reprezinta o abordare alternativa a procedeului de microincapsulare.

Diseminarea rezultatelor pe scară largă

• Cerere de brevet OSIM (A/00670/08.11.2021) cu titlul "ALIMENT FUNCȚIONAL UTILIZABIL CA ADJUVANT ÎN DIETA HIPOCALORICĂ ȘI PROCEDEU DE OBȚINERE";
• Comunicari:
  - Forest fruits processing by-products and chia seeds as ingredients for a new functional food, Anca Oancea, Elena Mihai, Teodora Ciucan, Viorica Coroiu, Ana-Maria Ghenea, Stefania Adelina Milea, The 10th International Symposium EUROALIMENT, 7-8 October 2021, Online;
  - Synergic antioxidant activity of polyphenols and polysaccharides from forest fruits pomace and chia seeds used as ingredients of a new functional food, Mihai, E., Utoiu, E., Sanda, C., Ciucan, T., Ilie, D., Ghenea, A-M., Oancea, A., Advances in Food Chemistry International Conference (AdFoodChem), April 15-17, 2021, Online;
  - In vitro antioxidant activity determination of a microencapsulated synergic polyphenols – polysaccharide mixture, Elena MIHAI, Teodora CIUCAN, Andreea IOSAGEANU, Viorica COROIU, Ana-Maria GHEORGHE, Stefania Adelina MILEA, Anca OANCEA, The International Symposium PRIOCHEM, XVIIth Edition, ICECHIM - Bucharest – ROMANIA, October 27 - 29, 2021.
• Lucrare:
  - Mechanisms and Pharmaceutical Action of Lipid Nanoformulation of Natural Bioactive Compounds as Efficient Delivery Systems in the Therapy of Osteoarthritis, Oana Craciunescu, Madalina Icriverzi, Paula Ecaterina Florian, Anca Roseanu and Mihaela Trif, PHARMACEUTICS, Volume 13, Issue 8, Article Number 1108, DOI 10.3390/pharmaceutics13081108, Published AUG 2021.